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Fragestellung: In Vorarbeiten konnten wir zeigen, dass sich mesenchymale Stammzellen (MSZ) für die Knorpelregeneration mittels Gentransfer von Mitgliedern der TGF-b Superfamilie zwar chondrogen differenzieren lassen, jedoch ein Hohes Maß an hypertropher Enddifferenzierung mit nachfolgender Apoptose aufweisen, was für die Geweberegeneration als deletär einzustufen ist. Da der Transkriptionsfaktor SOX-9 als Inhibitor der Hypertrophie in der Literatur beschrieben ist, untersucht diese in vitro Studie, ob Gentransfer von SOX-9 alleine oder in Kombination mit TGF-b1 oder IGF-1 in der Lage ist Chondrogenese in MSZ unter Reduktion von hypertrophen Enddifferenzierungsstadien zu induzieren.

Methodik: Adenovirale Vektoren der ersten Generation wurden für SOX-9/GFP herstellt und wie die vorhandenen Vektoren für GFP, TGF-b1 und IGF-1 verwendet. Humane adulte MSZ aus dem Knochenmark wurden nach adhärenter Kultur mit o.g. Vektoren bei jeweils 50 MOI (multiplicities of infection) mit SOX-9/GFP, IGF-1 oder TGF-b1 alleine oder in Kombination infiziert. Danach wurden die jeweils genetisch-modifizierten MSZ als Pellets (jeweils 3*105 Zellen/Pellet) in chondrogenem Differenzierungsmedium (ITS/ Dexamethason/ Ascorbat) für 3 Wochen kultiviert. Untransduzierte und GFP-transduzierte Kulturen dienten als Kontrollen. Die Auswertung der Transgenexpressionen erfolgte mittels ELISA (TGF-b1, IGF-1) und FACS (GFP), die der Chondrogenese und Hypertrophiestadien erfolgte histologisch, quantitativ biochemisch und mittels qRT-PCR.

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Wie bereits für TGF-b1 bekannt, ist der Gentransfer von SOX-9 alleine und in Kombination geeignet MSZ in Pelletkultur chondrogen zu differenzieren (Alcianblau und Col2 pos). Die Kontrollen und die IGF-1 alleine modifizierten Pellets waren nicht chondrogen. Kulturen, die mit TGF-b1 alleine oder in Kombination chondrogen induziert wurden zeigten ein quantitativ höheres Ausmaß an Chondrogenese (GAG Assay) und Hypertrophie (ALP, Col10) und frühe Apoptosestadien (Annexin5), als die Pellets nach Modifikation mit SOX-9 alleine oder SOX-9/IGF-1. Dies bestätigten die qRT-PCR Analysen, die eine vergleichbare Expression knorpelspezifischer Markergene (Col2, 9, 11, Aggrecan) und eine höhere Expression Hypertrophie-assoziierter Markergene (ALP, OP, Col10, PTH-rP, IHH) in den TGF-b1 enthaltenden Kulturen im Vergleich zu den Kulturen, die mit SOX-9 alleine oder zusammen mit IGF-1 transduziert wurden.

Nach unserer Ansicht stellt somit der Gentransfer von SOX-9 und SOX-9/IGF-1 eine geeignete Methode dar MSZ für die Knorpelregeneration chondrogen zu differenzieren, wobei späte Enddifferenzierungsstadien im Vergleich zu Kulturen die mit TGF-b modifiziert wurden deutlich reduziert werden können. Ob die Reduktion der hypertrophen Enddifferenzierung von chondrogen differenzierten MSZ mittels SOX-9 Gentransfer letztlich zur Erzeugung von langzeitstabilem Neoknorpel in vivo beitragen kann, sollen die derzeit laufenden Tierexperimente zeigen.