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Humanserum versus fetales Kälberserum bei Isolierung und Kultivierung humaner Chondrocyten
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Authors
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O. Pullig
- Waldkrankenhaus "Rudolf Elle" gGmbH, Lehrstuhl für Orthopädie der Universität Jena, Eisenberg, Germany
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C. Voigt
- Waldkrankenhaus "Rudolf Elle" gGmbH, Lehrstuhl für Orthopädie der Universität Jena, Eisenberg, Germany
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S. Neumann
- Waldkrankenhaus "Rudolf Elle" gGmbH, Lehrstuhl für Orthopädie der Universität Jena, Eisenberg, Germany
| Published: | October 15, 2009 |
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Fragestellung: Im Rahmen der autologen Chondrocyten Transplantation ist die Isolierung und Kultivierung der Chondrocyten ein wichtiger Schritt, da es hierbei zu massiven Veränderungen des chondrocytären Phänotyps kommt. Zur Nährstoffversorgung der Zellen werden Isolierungs- und Kulturmedien mit humanem Serum (HuS) oder fetalem Kälberserum (FCS) supplementiert. Beide Mediumzusätze befinden sich in klinischer Anwendung. In dieser vergleichenden Untersuchung wurde erstmals der Einfluss von HuS und FCS auf das Expressionsverhalten von Chondrocyten während der Isolierung bestimmt.
Methodik: Humane Chondrocyten aus artikulärem Knorpel wurden enzymatisch in DMEM Medium isoliert. Verdaumedien wurden entweder mit 5% HuS (aktivkohlebehandelt, gepoolt von 400 Patienten) (N=12) oder mit 5% FCS (N=8) supplementiert. Nach Verdau (22 h) erfolgte Zellzahlbestimmung sowie Analyse der Genexpression kartilaginärer Markergene (GAPDH, Kollagen- Typ II, I, X, MMP-3, real-time PCR). Für nachfolgende 2D Kulturen wurden jeweils 200.000 Zellen in DMEM Medium plus 5% HuS (N=6) oder 5% FCS (N=6) kultiviert. Nach 10-tägiger Kultur erfolgte die Bestimmung der Zellzahl und der Genexpression. Beide Seren wurden quantitativ auf ihre Zusammensetzung analysiert.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Die Zellzahl nach Isolierung in HuS lag bei 5,1x106 ±0,3x106; bei FCS wurden 4,3x106 ±0,5x106 gezählt. Die Analyse der Genexpression nach Isolierung ergab eine höhere metabolische Aktivität in HuS versus FCS: GAPDH 2,8x; Kollagen Typ I 4,6x; Kollagen Typ II 2,2x; Kollagen Typ X 2,4x. Die MMP-3 mRNA (Kopienanzahl) war 2,3x erniedrigt gegenüber FCS. Nach Normalisierung auf GAPDH ergaben sich für HuS höhere Werte für Kollagen-Typ I- und -Typ X -mRNA, vergleichbare Werte für Kollagen Typ II mRNA und signifikant niedrigere Werte für MMP-3 mRNA (p≤ 0.01).
Die anschließende Monolayerkultur ergab für HuS signifikant höhere Zellausbeuten (2,4x, p≤ 0.01). Die Genexpression von Kollagen Typ X und MMP-3 waren signifikant erniedrigt; Kollagen Typ II mRNA war geringer und Kollagen Typ I mRNA vergleichbar mit Genexpressionen bei FCS Zugabe.
Die erhöhte Proliferationsrate und differente metabolische Aktivität humaner Chondrocyten bei Verwendung von HuS ist durch die Serumzusammensetzung erklärbar. So ist der Gehalt an Glucose in HuS erhöht (5,11 mM in HuS, 2,56 mM in FCS) wie auch die Konzentrationen wichtiger chondroaktiver Mediatoren (Insulin [μU]: 3,4 in HuS; <1 in FCS; IGF-1 [mg/ml]: 105 in HuS, 67 in FCS; PTH [pg/ml]: 31 in HuS, <10 in FCS).
Die Verwendung von HuS bei Isolierung und Kultivierung humaner Chondrocyten ergab höherer Zellausbeuten und eine höhere metabolische Aktivität. Für Kollagen Typ II und Typ I zeigten sich vergleichbare Expressionen. Die bei HuS reduzierte Expression des katabolen Enzyms MMP-3 und des Dedifferenzierungsmarkers Kollagen Typ X wie auch eine erhöhte klinische Akzeptanz begünstigen die Verwendung von HuS bei der Isolierung von Chondrocyten im Rahmen der therapeutischen Knorpelregeneration.
