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Überexpression von humanem IGF-I via rAAV stimuliert die Proliferation und Matrix-Synthese in humanen normalen und arthrotischen Chondrozyten in situ
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Authors
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MadryM. Cucchiarini
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Experimentelle Orthopädie und Arthroseforschung, Homburg, Germany
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D.M. Kohn
- Uniklinikum des Saarlandes, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg/Saar, Germany
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H. Madry
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Experimentelle Orthopädie und Arthroseforschung, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
| Published: | October 18, 2011 |
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Fragestellung: Der Gentransfer therapeutischer Faktoren ist eine vielversprechende Methode, reparative Prozesse bei Gelenkknorpeldefekten zu verbessern. Wir testeten die Hypothese, daß nach Konstruktion eines rAAV-IGF-I-Vektors die Überexpression von IGF-I die proliferativen und metabolischen Eigenschaften von normalen und arthrotischen Chondrozyten in humanen Gelenkknorpelexplantaten stimuliert.
Methodik: Alle Transgene standen unter Kontrolle des CMV-IE Promotor/Enhancers: Beta-Galaktosidase (β-gal) von E. coli (rAAV-lacZ) und humaner insulinartiger Wachstumsfaktor I (IGF-I) (rAAV-hIGF-I). Humane normale und arthrotische Gelenkknorpelexplantate wurden durch rAAV transduziert und anschließend die Transgenexpression per IGF-I-ELISA analysiert. Der DNS-, Proteoglykan- und Typ-II-Kollagengehalt wurde mittels Hoechst 33258, DMMB und ELISA bestimmt. Histologische und immunhistochemische Analysen wurden an Safranin O, Hämatoxylin-Eosin und Typ-II-Kollagen gefärbten Paraffinschnitten 12 Tage nach Transduktion durchgeführt. Morphometrische Messungen wurden an 3 standardisierten Stellen der Proben durchgeführt. Daten wurden geblindet von zwei individuellen Personen erhoben. Jede Kondition (n=3) wurde in zwei unabhängigen Experimenten überprüft. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Eine effiziente IGF-I-Überexpression über einen Zeitraum von mindestens 12 Tagen resultierte nach rAAV-IGF-I-Gentransfer in humanen normalen und arthrotischen Gelenkknorpelexplantaten (bis zu 8,5-fach höher als in der rAAV-lacZ-Kontrolle; P≤0,001). Ebenso führte die Überexpression von hIGF-I durch rAAV in den normalen und arthrotischen Explantaten zu einer signifikant gesteigerten Zelldichte (1,5-fach; P≤0,001), DNS-Gehalt (bis zu 2,1-fach; P≤0,001), Matrix-Anfärbbarkeit (bis zu 5,8-fach; P≤0,001), Proteoglykan-Gehalt (bis zu 9,4-fach; P≤0,001), Typ-II-Kollagen-Immunfärbungsintensität (bis zu 5,5-fach; P≤0,001) und Typ-II-Kollagen-Gehalt (bis zu 5,7-fach; P≤0,001).
Die Daten zeigen, daß die effiziente rAAV-vermittelte Überexpression von IGF-I signifikant die Zellproliferation von humanen normalen und arthrotischen Chondrozyten in situ stimuliert. IGF-I-Überexpression steigert ebenfalls simultan die Synthese der beiden wichtigen Matrixbestandteile Proteoglykan und Typ-II-Kollagen. Weitergehende Studien müssen den therapeutischen Nutzen von rAAV-IGF-I für die Knorpelreparatur in vivo evaluieren.
