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Die Inhibition des Transkriptionsfaktors Sox9 beeinflusst Proliferation, Apoptose und osteogenes Differenzierungspotential von rMSC
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Authors
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S. Stöckl
- Orthopädische Klinik der Universität Regensburg, Experimentelle Orthopädie, ZMB im BioPark 1, Regensburg, Germany
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A. Bosserhoff
- Universität Regensburg, Institut für Pathologie, Regensburg, Germany
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C. Göttl
- Orthopädische Klinik der Universität Regensburg, Experimentelle Orthopädie, ZMB im BioPark 1, Regensburg, Germany
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J. Grifka
- Universitätsklinikum Regensburg, Klinik für Orthopädie, Asklepios Klinikum Bad Abbach, Bad Abbach, Germany
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S. Grässel
- Orthopädische Klinik der Universität Regensburg, Experimentelle Orthopädie, ZMB im BioPark 1, Regensburg, Germany
| Published: | October 18, 2011 |
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Fragestellung: Der Transkriptionsfaktor Sox9 spielt in mesenchymalen Stammzellen wie auch in Osteochondroprogenitorzellen, die zu Chondrozyten oder Osteoblasten differenzieren können, eine essenzielle Rolle.
Trotz seiner wichtigen Funktionen während der Chondrogenese in der embryonalen Skelettentwicklung gibt es noch unklare Aspekte bzgl. verschiedener downstream Effekte von Sox9 und dem temporären Einfluss des Sox9 - Genexpressionsspiegels auf die einzelnen Differenzierungsstadien während der Chondro- und Osteogenese.
Aus der Literatur gibt es außerdem Hinweise, dass Sox9 an anderen biologischen Prozessen im adulten Organismus wie der Proliferation oder Apoptose beteiligt sein könnte.
Methodik: Um dies zu untersuchen wurden rMSC aus dem femoralen Knochenmark (rBM-MSC) und dem subkutanen Fettgewebe (rAD-MSC) von jungen Ratten isoliert und mit einer Sox9-spezifischen shRNA, via Retroviren (Clontech TM pSIREN), transduziert. Der so erzeugte Sox9 Knockdown wurde nach 2-wöchiger Selektion auf RNA-Ebene durch qPCR und auf Proteinebene durch Western-Blot / Luciferase Reporterassay verifiziert. Der Effekt der Sox9 Inhibition auf verschiedene, z. T. downstream gelegene Gene in undifferenzierten sowie in osteogen differenzierten rMSC, wurde mittels qPCR untersucht. Die Proliferation nach Sox9 Reduktion wurde mit einem BrdU-ELISA und die apoptotische Aktivität anhand eines Caspase 3/7 Assay quantifiziert.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Ein reproduzierbarer Sox9 Knockdown zwischen 50% und 90% konnte in rMSCs erzeugt werden. Dieser wurde auf transkriptioneller und proteinchemischer Ebene nachgewiesen. Als downstream Effekt der Sox9 Inhibition konnte eine signifikante und physiologisch relevante Verringerung der Expression von Integrin alpha 11, Mmp-13 und Bcl-2, sowie eine erhöhte Osteocalcin Expression und Sekretion in undifferenzierten rBM-MSC gezeigt werden. Erste Sox9 Knockdownversuche mit rAD-MSC bestätigen diese Expressionsdaten.
Nach 14 Tagen osteogener Differenzierung zeigten rBM-MSC mit inhibiertem Sox9 eine erhöhte Expression der Osteogenesemarker Runx2, Osteocalcin, Mmp13 und Vegfa.
Die Proliferationsrate in Sox9 Knockdownzellen war um 20% vermindert, die apoptotische Aktivität um 12% erhöht.
Unsere Ergebnisse zeigen einen positiven Effekt von Sox9 auf die Zellproliferation sowie eine negative Regulierung der Apoptose. Die Reduktion von Bcl-2 nach Sox9 Inhibition könnte Apoptose in undifferenzierten MSC induzieren, um vermutlich eine fehlerhafte Differenzierung zu verhindern.
Die Osteogenese-Studien zeigen, dass eine verminderte Sox9 Dosis die Regulation der osteogenen Differenzierung in rMSCs beeinflusst. Bereits die erhöhte Osteocalcin Expression in undifferenzierten rBM-MSC sowie rAD-MSC deutete auf einen pro-osteogenen Effekt einer Sox9 Reduktion hin. Dies könnte einen Hinweis auf eine direkte oder indirekte Interaktion von Sox9 und Osteocalcin oder einen Runx2 (wichtigster stimulierender TF der Osteocalcin Genexpression) inhibierenden/aktivierenden Kofaktor des osteogenen Differenzierungswegs geben.
