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Unter Extrazellulären Matrix (ECM) Synthese-Bedingungen beeinflussen Scleraxis und E47 die DNA-Menge in humanen mesenchymalen Stammzellen
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Published: | October 2, 2012 |
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Fragestellung: Eine beschleunigte Heilung von Sehnen- und Bändererkrankungen wäre ein wichtiger therapeutischer Fortschritt. Unter anderem kann eine veränderte Struktur oder Zusammensetzung der Extrazellulärmatrix eine Ursache von Sehnen-Erkrankungen, z.B. von Tendinopathien, sein [1]. Wir entwickelten die Hypothese, dass die Überexpression des gewebespezifischen Transkriptionsfaktors Scleraxis zusammen mit ubiquitär exprimierten E2A-Proteinen (E12, E47) in mesenchymalen Stammzellen in vitro und in vivo die Ausbildung sehnen-ähnlicher Zellen und entsprechender Extrazellulärmatrix (ECM) vermitteln kann.
Methodik: Zur gentechnischen Veränderung von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) wurden konditional exprimierende Lentiviren eingesetzt und die Zellen einem sog. tendogenen Induktionsprotokoll unterzogen (50 µM Ascorbat-2-Phosphat, 10 mM Beta-Glycerophosphat, bis zu 21 Tage). Western Blots dienten zur Analyse der Proteinexpression. Genexpressionsanalysen erfolgten durch semiquantitative und quantitative realtime RT-PCR. Histologische Färbungen wurden zur Analyse der ECM durchgeführt. Der Nachweis von Glycosaminoglycanen erfolgte mit Dimethylmethylenblau. Der DNA-Gehalt wurde mit Bisbenzimid H33342 bestimmt.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Die Gene für Scx, E12 und E47 werden endogen in humanen MSCs synthetisiert. Scx-mRNA ist dabei generell zu einem deutlich geringeren Anteil vorhanden, während E12- und E47-mRNAs in ähnlicher Menge gebildet werden. Bei einzelnen Spendern sind die mRNA-Mengen unterschiedlich und sinken teilweise im Lauf der in vitro-Kultivierung der MSCs mit zunehmender Passagenzahl. Durch Lentiviren wurden Scx, E12 und E47 allein oder in Kombination in humane MSCs eingebracht. Safranin O-Färbungen waren nach Überexpression von E47 leicht und für die Kombination von Scx+E47 deutlich positiv, während in Kontrollmedium (ohne Zusätze) keine Färbung stattfand. Molekulare Basis hierfür könnte eine Geninduktion von sulfatierten Proteoglycanen sein, welche von Safranin O detektiert werden. Mit der biochemischen Methode zur Quantifizierung der Glycosaminoglycane konnte jedoch keine erhöhte Synthese von Glycosaminoglycanen detektiert werden. Die mRNA-Expression einer Reihe von Proteoglycanen blieb ebenfalls unverändert. Stattdessen konnte in den Scx+E47-überexprimierenden Zellen eine deutliche Erhöhung des DNA-Gehaltes nachgewiesen werden.
Schlussfolgerung: Die beobachteten Effekte sind von der Gabe von Ascorbat-2-Phosphat und Beta-Glycerophosphat abhängig, da sie in Kontrollmedium nicht auftraten. Die relativ spezifische Safranin O-Färbung bei Überexpression von Scx+E47 konnte jedoch nicht durch erhöhte Synthese von Proteoglycan-mRNAs erklärt werden, sondern scheint mit einer erhöhten DNA-Menge zusammenzuhängen, deren Ursache aktuell erforscht wird.