Authors:	Holtkamp, Silke
Title:	RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten
Online publication date:	7-Oct-2020
Year of first publication:	2007
Language:	german
Abstract:	Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endgültige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abhängig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter für die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schlüsselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilität und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabhängigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem kürzeren, ein freies 3´ poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte β-globin 3´ UTR, unabhängig voneinander zu einer Erhöhung der IVT-RNA Stabilität und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erhöhten Proteinexpression führten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination führte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erhöhten Dichte und Stabilität von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfläche transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform für die Induktion einer verstärkten Antikörperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen- IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verstärkung der Antikörperantwort führen, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell bestätigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verstärkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verstärkung der Antikörperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA führte zu einer signifikant stärkeren Antikörperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. Für die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen führt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe für eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert. Antigen encoding RNA is regarded as a safe and efficient alternative to traditional protein-, peptide- or recombinant virus- or DNA-based vaccines. The success and the ultimate clinical utility of RNA based vaccines depends on the optimization of parameters contributing to the induction and efficient expansion of humoral and cellular immune responses. Based on theses assumptions, the objective of this doctoral thesis was the establishment of pharmacological and immunological parameters for the generation of effective immune responses by RNA-based vaccines as well as their effectiveness in vitro and in the mouse model by using model antigens. For the investigation and optimization of the RNA pharmacokinetic as a key aspect of clinical development, the impact of structural modifications on the transcript stability and translational efficiency of reporter protein was evaluated in time-kinetic studies. Using quantitative RT-PCR and eGFP variants to measure transcript amounts and protein yield, it was shown that (i) a poly(A) tail of 120 nucleotides length as compared to a shorter one, (ii) an unmasked poly(A) tail with a free 3’ end rather than one extended with unrelated nucleotides and (iii) two sequential β-globin 3’ untranslated regions cloned head-to-tail between the coding region and the poly(A) tail, independently enhance RNA stability and translational efficiency. Consecutively, the density of antigen-specific peptide/MHC complexes on the transfected cells as well as their potency to stimulate and expand antigen-specific CD4+ and CD8+ T-cells were increased. In order to improve the antibody immune response by modifying the shape of the RNA encoded antigen, an antigen-IgM fusion construct were generated and its suitability as a new vaccine format was explored in the second part of the thesis. The initial hypothesis, that RNA encoded antigen-IgM fusion proteins polymerizes, are secreted by transfected cells and because of their repetitive structure would lead to an improved antibody immune response was confirmed in vitro and in vivo in the mouse model. The development and evaluation of cytokine fusion-proteins for the selective improvement of antigen specific immune responses was the third major objective of this thesis. Based on the results of the second part, an IL2-IgM fusion construct was generated to further improve the antibody immune response. Co-transfection of antigen-IgM and IL2-IgM encoding IVT-RNA led to a significantly stronger antibody immune response than co-transfection of antigen-IgM and IL2. For the initiation of a successful anti-tumor immune response, the Priming of antigen-specific T-cells is essential. To increase the efficiency of this process, a bi-functional IL2-mCD40L fusion-construct was cloned and its influence on the effector function of transfected DCs was examined in vitro and in vivo. It could be shown, that RNA encoded IL2-mCD40L fusion-protein increases the Priming of cytotoxic T-cells. In summary, RNA based vaccines were further improved by the optimization of their pharmacokinetic, the modification of the antigen-shape and the production and evaluation of cytokine fusion-proteins as molecular adjuvant. Each aspect contributed to a stronger induction of antigen-specific immune responses.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5187
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-12958
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Publisher:	Johannes Gutenberg-Universität
Publisher place:	Mainz
Issue date:	2007
Appears in collections:	JGU-Publikationen