Authors:	Kirste, Vinzenz Ulrich
Title:	Elektrochemisch gesteuerte zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie an Redox-Membranproteinen in einer biomimetischen Membran-Architektur
Online publication date:	7-Jan-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Das Protein Cytochrom c Oxidase (CcO) ist ein Enzym der mitochondrialen Atmungskette. Als letzter Komplex (Komplex IV) einer Elektronentransportkette katalysiert sie die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Hierbei werden Elektronen von Cytochrom c (Cc) in das Enzym geleitet. Die durch den Redoxprozess freiwerdende freie Enthalpie wird dazu genutzt, einen Protonengradienten über die innere Mitochondrien-Membran aufzubauen. Die zurückwandernden Protonen treiben in der ATP-Synthase die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) an, dem universellen Energieträger in lebenden Organismen. Gegenstand dieser Dissertation sind zeitaufgelöste ATR-FTIR-Messungen des direkten Elektronentransfers in die CcO. Das Protein wird hierzu orientiert auf einer Goldelektrode immobilisiert und in eine künstliche Membran rekonstituiert (Protein-tethered Bilayer Lipid Membrane, ptBLM). Das ptBLM-System wird hinsichtlich einer möglichst hohen Protein-Aktivität optimiert. Elektronen werden durch elektrochemische Anregung von der Elektrode in die CcO injiziert. Die Goldoberfläche wird auf die reflektierende Oberfläche eines Silizium-ATR-Kristalls aufgebracht. Durch die Präparation einer rauen Oberfläche (RMS-Rauigkeit ca. 5 nm) wird eine Verstärkung der IR-Absorption erreicht. Die mit den Ladungstransferprozessen einhergehenden Konformationsänderungen der die Redoxzentren umgebenden Gruppen (CONH-Gerüst und Aminosäure-Seitenketten) können durch Infrarot- Spektroskopie nachgewiesen werden. Phasensensitive Detektion (PSD) wird zur Rauschminderung eingesetzt, um Geschwindigkeitskonstanten für die Redox-Übergänge zu bestimmen. Im Bereich der Amid-I-Bande werden etliche Peaks identifiziert, die sich mit dem Redoxzustand des Proteins ändern. Für das CuA-Zentrum, welches als erstes der vier Redoxzentren der CcO reduziert wird, wird die schnellste Geschwindigkeitskonstante ks=4870/s ermittelt. Für das Häm a3-Zentrum wird eine Geschwindigkeitskonstante von ks=13,8/s ermittelt. Die Ergebnisse sind konsistent zu elektrochemischen und Raman-Spektroskopie-Experimenten, welche ebenfalls in unserer Gruppe durchgeführt wurden. Weitere Themen dieser Dissertation sind der Nachweis der Anwendbarkeit des ptBLM-Systems für andere Membranproteine (Beispiel: bakterielles photosynthetisches Reaktionszentrum) und der Einsatz des ATR-FTIR-Setups für verschiedene künstliche Membransysteme (Aktivitätsnachweis des OR5-Geruchsrezeptors in einer peptidgestützten Membran, Eigenschaften eines Oligoethylenglycol-Spacers). The protein Cytochrome c Oxidase (CcO) is part of the mitochondrial respiratory chain. It is the last complex (complex IV) of this electron transport chain and catalyzes the reduction of molecular oxygen to water. Electrons are transferred from Cytochrom c (Cc) into the enzyme. The free enthalpy which is released during this redox reaction is used to build a proton gradient over the inner mitochondrial membrane. The protons are transferred back into the matrix by the ATP synthase and drive the synthesis of adenosine triphosphate (ATP), which is the universal energy source of living organisms. This thesis deals with time-resolved ATR-FTIR-measurements of direct electron transfer into CcO. The protein is therefore immobilised on a gold electrode in a strictly oriented fashion and reconstituted in an artificial membrane (protein-tethered bilayer lipid membrane, ptBLM). The ptBLM-system is optimized in terms of a high protein activity. Electrons are injected by electrochemical excitation from the electrode into the CcO. The gold surface is deposited on top of the reflecting surface of a silicon ATR-crystal. Using a rough gold surface (RMS roughness ca. 5 nm) leads to an enhancement of the infrared absorption. Conformational changes of groups surrounding the redox centres (CONH backbone and amino-acid side chains) related to the charge transfer processes are detected by infrared spectroscopy. Phase sensitive detection is used to improve the signal-to-noise ratio (SNR) in order to calculate rate constants for the redox transitions. In the region of the amide-I-band several peaks can be identified, which change with the redox state of the protein. For the CuA center, which is reduced as the first of the four redox centres, the highest rate constant of ks=4870/s is calculated. For the heme a3 center a rate constant of ks=13,8/s is calculated. The results are consistent with electrochemical and Raman-spectroscopy experiments, which were also performed by our group. Further topics of this thesis are the proof of the ptBLM-system for other membrane proteins (e.g. the bacterial photosynthetic reaction center) and the applicability of the ATR-FTIR-setup for different artificial membrane systems (proof of the activity of an OR5 odorant receptor in a peptide supported membrane, characteristics of an oligoethylenglycol-spacer).
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3999
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-15209
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen