Authors:	Appel, Nicole
Title:	Structural and functional analysis of the hepatitis C virus non-structural protein 5A
Online publication date:	13-Jan-2005
Year of first publication:	2005
Language:	english
Abstract:	Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes RNA Virus aus der Familie der Flaviviridae. Sein Genom kodiert für ein ca. 3000 Aminosäuren langes Polyprotein, welches co- und posttranslational in seine funktionellen Einheiten gespalten wird. Eines dieser viralen Proteine ist NS5A. Es handelt sich hierbei um ein stark phosphoryliertes Protein, das eine amphipatische α-Helix im Amino-Terminus trägt, welche für die Membran-Assoziation von NS5A verantwortlich ist. Welche Rolle die Phosphorylierung für die Funktion des Proteins spielt, bzw. welche Funktion NS5A überhaupt ausübt, ist zur Zeit noch unklar. Beobachtungen lassen Vermutungen über eine Funktion von NS5A bei der Resistenz infizierter Zellen gegenüber Interferon-alpha zu. Weiterhin wird vermutet, das NS5A als Komponente des membranständigen HCV Replikasekomplexes an der RNA Replikation beteiligt ist. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Funktion von NS5A für die RNA Replikation zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine Serie von Phosphorylierungsstellen-Mutanten generiert, die auf Ihre Replikationsfähigkeit und den Phosphorylierungsstatus hin untersucht wurden. Wir fanden, dass bestimmte Serin-Substitutionen im Zentrum von NS5A zu einer gesteigerten RNA Replikation führten, bei gleichzeitig reduzierter NS5A Hyperphosphorylierung. Weiterhin studierten wir den Einfluß von Mutationen in der Amino-terminalen amphipatischen α-Helix von NS5A auf die RNA-Replikation, sowie Phosphorylierung und subzelluläre Lokalisation des Proteins. Wir fanden, dass geringfügige strukturelle Veränderungen der amphipatischen Helix zu einer veränderten subzellulären Lokalisation von NS5A führten, was mit einer reduzierten oder komplett inhibierten RNA Replikation einherging. Zudem interferierten die strukturellen Veränderungen mit der Hyperphosphorylierung des Proteins, was den Schluß nahe legt, dass die amphipatische Helix eine wichtige strukturelle Komponente des Proteins darstellt, die für die korrekte Faltung und Phosphorylierung des Proteins essentiell ist. Als weitere Aspekte wurden die Trans-Komplementationsfähigkeit der verschiedenen viralen Komponenten des HCV Replikasekomplexes untersucht, sowie zelluläre Interaktionspartner von NS5A identifiziert. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, dass NS5A eine wichtige Rolle bei der RNA-Replikation spielt. Diese Funktion wird wahrscheinlich über den Phosphorylierungszustand des Proteins reguliert. Hepatitis C virus (HCV) is an enveloped, positive-strand RNA virus that belongs to the family Flaviviridae. Its genome encodes a polyprotein with a length of about 3000 amino acids. This polyprotein is cleaved into 10 different products. One of these is NS5A, a highly phosphorylated protein that contains an amphipathic alpha-helix at the N-terminus responsible for membrane association of the protein. NS5A is implicated in counteracting the antiviral state that is induced by interferon-alpha. In addition, it is assumed to be involved in RNA replication. It was the overall aim of this PhD thesis to gain insight into the role of NS5A for RNA replication. A large panel of mutations affecting potential phospho acceptor sites were designed and analyzed for their replication ability and phosphorylation status. We found that certain serine substitutions in the center of NS5A enhanced RNA replication concomitant with a reduction of NS5A hyperphosphorylation. Second, we studied the impact of mutations in the N-terminal amphipathic alpha-helix of NS5A on membrane association, RNA replication and NS5A phosphorylation. Structural changes of the alpha-helix were found to disturb incorporation of NS5A into the HCV replicase complex, concomitant with a block of RNA replication. Furthermore, these mutations interfered with hyperphosphorylation of NS5A arguing that the amphipathic alpha-helix is required to ensure proper folding and phosphorylation of NS5A, which in turn is required for RNA replication. Third, we wanted to know whether components of the HCV replicase complex (RC) are strictly cis-acting or can be complemented in trans. To address this question, two alternative trans-complementation assays were established. We found that NS5A is the only non- structural protein that can be complemented in trans. In the last chapter of this thesis, we aimed at the identification of cellular phosphoproteins that interact with NS5A. In the course of this study, amphiphysin II was identified as a novel NS5A interaction partner. In summary, these data show that NS5A plays a very important role for RNA replication that is most likely regulated by its phosphorylation status. Based on most recent data, showing that adaptive mutations in NS5A enhance RNA replication, but reduce virion formation, we speculate that NS5A may be a key regulator of the switch from RNA replication to virus assembly. This switch may be regulated by differential phosphorylation of this important protein.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3061
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-6510
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen